REAL DECRETO 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Lista de plantas huésped de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.a las que se refiere el artículo 1

Plantas (incluidos los tubérculos), salvo las semillas verdaderas, de Solanum tuberosum L.: Patata.

Plantas, salvo las semillas y los frutos, de Lycopersicum lycopersicum (L.) Karsten ex Farw.: Tomate.

Exámenes

1. ?Los exámenes oficiales contemplados en la letra a) del apartado 2 del artículo 3 se basarán en la biología del organismo, así como en los sistemas de producción concretos que se utilicen en la Comunidad Autónoma de que se trate, e incluirán lo siguiente:

   i)?en el caso de las patatas:

   en los momentos oportunos, una inspección visual del cultivo en crecimiento, y/o muestras de patatas de siembra y de otras patatas durante la fase de crecimiento o almacenadas; estas muestras se someterán a una inspección visual oficial o bajo supervisión oficial, para lo cual se procederá a seccionar los tubérculos, y

   en el caso de las patatas de siembra y, si procede, de otras patatas, análisis de laboratorio oficiales o bajo supervisión oficial en los que se utilice el método establecido en el anexo II del presente Real Decreto;

   ii)?en el caso de los tomates:

   en los momentos oportunos, una inspección visual de, al menos, el cultivo en crecimiento de plantas destinadas a la replantación para utilización profesional.

2. ?La notificación de los exámenes oficiales dispuesta en el apartado 3 del artículo 3 incluirá los datos siguientes:

   i)?en el caso de los exámenes de patatas:

   la superficie total estimada, en hectáreas, de los cultivos de patatas de siembra y de otras patatas,

   la clasificación por categorías (de siembra y de consumo) y, en su caso, por regiones,

   la cantidad de muestras tomadas para los análisis y el momento de su recogida,

   el número de inspecciones visuales efectuadas en el campo,

   el número de inspecciones visuales realizadas en tubérculos (y la cantidad de muestras);

   ii)?en el caso de los exámenes de, al menos, el cultivo en crecimiento de plantas de tomate destinadas a la replantación para utilización profesional:

   la cantidad total estimada de plantas,

   el número de inspecciones visuales;

   iii) en el caso de los exámenes de plantas huésped del organismo distintas de la patata y el tomate, incluidas las solanáceas silvestres huésped:

   la especie,

   la cantidad de muestras tomadas y el momento de su recogida,

   la zona o río objeto del muestreo, según proceda, el método de análisis;

   iv)?en el caso de los exámenes de aguas y de los vertidos de residuos líquidos procedentes de las instalaciones industriales de transformación o de embalaje:

   la cantidad de muestras tomadas y el momento de su recogida,

   la zona, río o ubicación de la instalación objeto del

   muestreo, según corresponda, el método de análisis.

Aplicación del método

1. ?Diagnóstico de la podredumbre parda en los tubérculos de patata y de la marchitez bacteriana en las plantas de patata y de tomate:

   El procedimiento de análisis se refiere a los tubérculos de patata que presentan síntomas típicos de la podredumbre parda y a las plantas de patata y de tomate que presentan síntomas típicos o que permiten la sospecha de marchitez bacteriana e incluye una prueba de selección rápida, el aislamiento del patógeno del tejido vascular infectado en un medio de cultivo apropiado y, en caso de resultado positivo, la identificación del cultivo como Ralstonia solanacearum.

   Notas:

   (¹)?La descripción de los síntomas se presenta en el punto 1 de la sección II.

   (²)?Las pruebas de selección rápida facilitan un diagnóstico presuntivo.

   Son pruebas adecuadas:

   la prueba de la exudación del tejido vascular del tallo (punto 2 de la sección II),

   la prueba de detección de gránulos de poli-ß-hidroxibutirato (punto 2 de la sección II),

   la prueba IF (punto 2 de la sección III),

   la prueba ELISA (punto 3 de la sección III),

   la prueba PCR (punto 4 de la sección III).

   (³)?Aunque el aislamiento del patógeno de material vegetal con síntomas típicos es sencillo mediante siembra de diluciones, el cultivo puede fallar en estados avanzados de infección. Las bacterias saprofitas que crecen en el tejido enfermo pueden enmascarar o inhibir el patógeno en el medio de aislamiento. Si el aislamiento es negativo, pero los síntomas de la enfermedad son los típicos, deberá repetirse el aislamiento, preferentemente valiéndose de una siembra en medio selectivo.

   (⁴)?La identificación fiable de un cultivo puro de Ralstonia solanacearumse consigue utilizando al menos una de las pruebas que se enumeran en el punto 4.1 de la sección II, en combinación con una prueba de patogenicidad (punto 4.3 de la sección II). La caracterización de la cepa es facultativa, aunque se recomienda cada vez que se presente un caso nuevo.

2. ?Detección e identificación de Ralstonia solanacearumen muestras de tubérculos de patata:

   El procedimiento se destina a la detección de infecciones latentes en tubérculos de patata mediante una o, preferiblemente, varias pruebas de selección que, de ser positivas, se complementan con el aislamiento del patógeno; en caso de aislamiento de colonias típicas, se procede a continuación a la identificación de un cultivo puro como Ralstonia solanacearum.

   Notas:

   (¹)?Tamaño de la muestra: El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos. Sin embargo, el procedimiento puede adaptarse convenientemente para muestras con menos de 200 tubérculos.

   (²)?Pruebas de selección: Es posible que una única prueba no sea lo suficientemente sensible o fiable para detectar Ralstonia solanacearum en una muestra. Por ello se recomienda realizar más de una prueba y que se basen en principios biológicos diferentes.

   (³)?Prueba de inmunofluorescencia (IF): La prueba IF es una prueba de selección plenamente reconocida, lo que supone una ventaja frente a otras pruebas que aún no han sido puestas a punto o convalidadas completamente. La prueba se usa para otras muchas bacterias, por ejemplo Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Los parámetros de lectura que se especifican en este método hacen que resulte una prueba sensible (con límites de detección de 10³-10⁴ células por ml de precipitado resuspendido). Se prefiere el método indirecto. El método directo puede aplicarse si la prueba tiene un grado de sensibilidad y especificidad equivalente al del método indirecto.

   El factor crítico en que se basa la fiabilidad de los resultados es la calidad del antisuero. Sólo es aceptable un antisuero con un título elevado (2000, como mínimo, para el antisuero crudo) y todas las pruebas deben realizarse a la dilución del título del antisuero o con una dilución por debajo de éste.

   La prueba IF presenta la ventaja de la interpretación subjetiva de la morfología de la tinción celular y de la intensidad de la fluorescencia, que facilitan información sobre la especificidad de la reacción. Son frecuentes las reacciones cruzadas producidas por bacterias serológicamente afines, procedentes del suelo o asociadas a tejidos de la patata, con morfología celular de Ralstonia solanacearum. Aunque la prueba IF puede utilizarse como única prueba de selección, cuando se sospeche que se han producido reacciones cruzadas convendrá efectuar una prueba de selección alternativa basada en principios biológicos diferentes. En tales casos la siembra en medio selectivo es la prueba más adecuada.

   (⁴)?Pruebas de siembra en medio selectivo: El medio SMSA modificado y el procedimiento que se especifican en este método hacen que ésta sea una prueba sensible y selectiva para la detección de Ralstonia solanacearum, cuyos resultados pueden conocerse de tres a seis días después de la siembra. El agente patógeno se obtiene directamente en cultivo y puede identificarse fácilmente. Para poder aprovechar plenamente el potencial de la prueba, es necesario preparar con cuidado las cuñas para evitar otras bacterias asociadas al tubérculo de la patata que compiten con Ralstonia solanacearum en el medio y pueden afectar el desarrollo del agente patógeno. Algunas cepas pueden crecer insuficientemente, ya que los componentes del medio pueden afectar al organismo buscado. Asimismo, debe tenerse cuidado para diferenciar Ralstonia solanacearum de otras bacterias que pueden desarrollarse en el medio. Aunque la siembra en medio selectivo puede utilizarse como única prueba de selección, cuando se obtengan resultados negativos y se sospeche que se ha producido una inhibición del crecimiento de Ralstonia solanacearum, debido a la presencia de otras bacterias en el medio, será conveniente realizar una segunda prueba de selección. En tal caso, la prueba IF será la más apropiada.

   (⁵)?Prueba ELISA: En general, la prueba ELISA es menos sensible que la prueba IF (límites de detección: 10⁴-10⁵ células por ml de precipitado de extracto de patata). Se trata de una prueba barata y rápida, que, no obstante, en lo que a resultados se refiere, está en general más expuesta a dar resultados falsos positivos (reacciones cruzadas) y falsos negativos (inhibición causada por moléculas fenólicas presentes en el extracto de patata). El antisuero debe poseer una especificidad muy elevada. La prueba ELISA no puede utilizarse como única prueba de selección.

   (⁶)?Prueba PCR: Esta prueba posee el potencial necesario para una gran sensibilidad de detección, pero puede ser inhibida fácilmente por componentes del extracto de planta o tubérculo, con el consiguiente resultado falso negativo. Algunos cultivares de patata contienen más inhibidores que otros, que es necesario eliminar. La inhibición puede reducirse mediante dilución, si bien con ello se diluyen también las poblaciones de Ralstonia solanacearum. Debe tenerse mucho cuidado en todas las fases de preparación de las muestras y de la prueba para evitar contaminaciones que darían lugar a resultados positivos falsos. También pueden darse resultados falsos positivos debido a secuencias homólogas de otros organismos. De ahí que la prueba PCR directa no pueda utilizarse como única prueba de selección.

   (⁷)?Prueba de enriquecimiento: La incubación de muestras de extracto de patata en un caldo semiselectivo, como el caldo SMSA modificado, permite la multiplicación de Ralstonia solanacearum y, lo que es más importante quizás, también diluye los inhibidores potenciales de las pruebas ELISA o PCR. De este modo, Ralstonia solanacearum puede detectarse mediante las pruebas IF, ELISA y PCR en un caldo de enriquecimiento. No recomendamos la realización de cultivos directos a partir de caldos enriquecidos, ya que estos métodos de enriquecimiento no se han ensayado y probado a fondo. Si se incluyen aquí es porque poseen un potencial considerable. No obstante, debido a la relativa falta de experiencia que se tiene de ellos, no pueden utilizarse como métodos de detección únicos.

   (⁸) Prueba de bioensayo: La prueba de bioensayo se usa para el aislamiento de Ralstonia solanacearum a partir de extracto de patatas mediante enriquecimiento selectivo de la bacteria en una planta huésped, y puede realizarse en plantas de tomate o en berenjenas. Exige que las condiciones de incubación sean óptimas, según se especifican en este método. Es muy probable que las bacterias inhibidoras de Ralstonia solanacearum en medio SMSA no interfieran en esta prueba.

   (⁹) Pruebas confirmatorias: La identificación fiable de un cultivo puro de Ralstonia solanacearumse efectúa mediante alguna de las pruebas que se enumeran en el punto 4.1 de la sección II, en combinación con una prueba de patogenicidad (punto 4.3 de la sección II). Aunque la caracterización de la cepa es optativa, se recomienda en cada caso nuevo.

Diagnóstico de la podredumbre parda en los tubérculos de patata y de la marchitez bacteriana en las plantas de patata y de tomate

1. ?Síntomas:

   1.1?Síntomas en la patata:

   En la planta. La fase inicial de la infección se caracteriza por un marchitamiento de las hojas en progresión ascendente hacia el extremo superior de la planta, bajo el efecto de las temperaturas diurnas altas, con una recuperación durante la noche. El marchitamiento se hace rápidamente irreversible y ocasiona la muerte de la planta. El tejido vascular de los tallos de las plantas marchitadas cortados transversalmente puede volverse pardo, y en la superficie del corte suele observarse un exudado mucoso blanquecino o éste puede extraerse apretando el tallo. Si se coloca verticalmente un tallo cortado en agua, de los haces vasculares salen hilos viscosos de dicho exudado.

   En el tubérculo. Los tubérculos de patata deben cortarse transversalmente cerca de la parte basal (estolón). En la fase inicial de la infección se produce una decoloración entre amarillo vítreo y pardo claro de la línea vascular, de la cual suele fluir espontáneamente un exudado mucoso crema pálido al cabo de varios minutos o cuando se hace una ligera presión con los pulgares en la piel próxima a la superficie del corte. Posteriormente, la decoloración vascular adquiere un tono pardo más marcado y la necrosis puede extenderse al tejido parenquimático. En las fases avanzadas, la infección progresa desde la parte basal y los ojos, pudiendo dar lugar a que se produzcan en la piel lesiones ligeramente hundidas de color pardo rojizo por las que fluyen bacterias, lo que hace que se adhieran partículas del suelo.

   1.2?Síntomas en el tomate:

   En la planta. El primer síntoma visible es el aspecto fláccido de las hojas más jóvenes. En condiciones medioambientales favorables para el patógeno (temperatura del suelo de unos 25 ºC, humedad saturada) se produce epinastia y marchitamiento de una parte o de la totalidad de la planta en pocos días, que desemboca en el colapso total de la misma. En condiciones menos favorables (temperatura del suelo por debajo de 21 ºC)?pueden surgir numerosas raíces adventicias del tallo. En ocasiones se observa un cordón grasiento a lo largo del tallo que demuestra la existencia de necrosis en el sistema vascular. Al cortar transversalmente el tallo, los tejidos vasculares del mismo, que presentan una decoloración parda, exudan gotas de líquido bacteriano blanco o amarillento.

2. ?Pruebas de selección rápida: Las pruebas de selección rápida facilitan un diagnóstico presuntivo. Realícese una o más de las siguientes pruebas:

   Prueba de la exudación del tallo: La presencia de Ralstonia solanacearumen tallos de patata o de tomate marchitos puede evaluarse utilizando la sencilla prueba que se indica a continuación.

   Cortar el tallo justo por encima del nivel del suelo. Colocar la superficie del corte en un vaso de precipitados que contenga agua. Poco después, de los haces vasculares saldrán espontáneamente hilos de exudado bacteriano. Este fenómeno no se producirá con ninguna otra bacteria que cause infecciones vasculares en las plantas de patata o de tomate.

   Prueba de la detección de gránulos de poli-ß-hidroxibutirato (PHB): Los gránulos de PHB de las células de Ralstonia solanacearum se visualizan tiñendo con azul Nilo A o negro Sudán B.

   Preparar un frotis del exudado o del tejido sospechoso en un portaobjetos, o un frotis de un cultivo de 48 horas en YPGA o SPA (apéndice 1). Preparar frotis de control positivo de una cepa de biovar 2 y raza 3 y, si se considera útil, un frotis de un control negativo. Dejar secar. Pasar con rapidez varias veces por la llama la cara inferior del portaobjetos hasta que el frotis quede fijado.

   Prueba del azul Nilo:

1. ?Bañar el frotis fijado con solución acuosa al 1 por 100 de azul Nilo A. Incubar durante 10 minutos a 55 ºC.

2. ?Escurrir la solución de tinción. Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo de papel.

3. ?Bañar el frotis con ácido acético acuoso al 8 por 100. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente. 4. Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Secar con un pañuelo de papel.

5. ?Humedecer de nuevo con una gota de agua.

   Tapar con un cubreobjetos.

6. ?Examinar el frotis tintado con un microscopio equipado con epifluorescencia a 450 nm con aceite de inmersión, a 1.000 aumentos.

   Observar si se produce la fluorescencia naranja brillante de los gránulos de PHB. Observar también con la luz normal para cerciorarse de que los gránulos son intracelulares y de que la morfología celular es la típica de Ralstonia solanacearum.

   Prueba del negro Sudán:

1. ?Bañar el frotis fijado con una solución de negro Sudán B al 0,3 por 100 en etanol del 70 por 100. Dejar en incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente.

2. ?Escurrir la solución de tinción. Lavar suavemente con agua del grifo durante unos instantes. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo de papel.

3. ?Sumergir brevemente el frotis en xilol. Secar con un pañuelo de papel. Precaución al usar el xilol que es un producto nocivo. Trabajar en campana de humos.

4. ?Bañar el frotis con safranina acuosa al 0,5 por 100 (p/v) y dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Precaución al usar la safranina que es un producto nocivo. Trabajar en campana de humos.

5. ?Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Secar con un pañuelo de papel. Tapar con un cubreobjetos.

6. ?Examinar la tinción con un microscopio óptico con luz transmitida con aceite de inmersión, a 1.000 aumentos.

   Los gránulos de PHB de las células de Ralstonia solanacearum se tiñen de negro azulado, mientras que las paredes de las células lo hacen de rosa.

   Otras pruebas: Otras pruebas adecuadas para una selección rápida son la prueba IF (punto 2 de la sección III), la prueba ELISA (punto 3 de la sección III) y la prueba PCR (punto 4 de la sección III).

3. ?Proceso de aislamiento:

   3.1?Coger exudado o pequeñas secciones de tejido decolorado del anillo vascular del tubérculo o de los haces vasculares del tallo de la planta de patata o de tomate. Poner en suspensión en un volumen reducido de agua destilada estéril o en tampón fosfato 50mM. Dejar reposar de 5 a 10 minutos.

   3.2?Preparar series de diluciones decimales de la suspensión, por ejemplo 1/10 y 1/100, o más si se considera necesario.

   3.3?Añadir un volumen normalizado de la suspensión y de las diluciones a un medio nutritivo general (NA, YPGA y SPA; apéndice 1) y/o a un medio de tetrazolio de Kelman (apéndice 1) y/o a un medio selectivo SMSA (apéndice 7). Extender o hacer estrías con una técnica adecuada de dilución en placas. Si se considera útil, preparar un conjunto de placas distintas con un cultivo de una suspensión celular diluida de una cepa virulenta de Ralstonia solanacearum de biovar 2 y raza 3 que se utilizará como control positivo.

   3.4?Dejar?en incubación las placas tres días a 28ºC. La incubación puede prolongarse hasta seis días si el crecimiento es lento, pero las colonias en SMSA con frecuencia se vuelven atípicas y mueren.

   En un medio nutritivo general, los aislados virulentos de Ralstonia solanacearum desarrollan colonias de color blanco nacarado, planas, irregulares y fluidas, que con frecuencia presentan los verticilos característicos.

   En el medio de tetrazolio de Kelman, las colonias típicas de aislados virulentos de Ralstonia solanacearum son de color crema, planas, irregulares, con anillos de color rojo sangre en el centro. Las colonias avirulentas de Ralstonia solanacearum son butirosas y de color rojo fuerte.

   En el medio SMSA, las colonias típicas de los aislados virulentos de Ralstonia solanacearum son de color blanco lechoso, planas, irregulares y fluidas, y presentan centros de un marcado color rojo sangre.

   Las formas avirulentas de Ralstonia solanacearum desarrollan colonias menos fluidas, cuyo color oscila entre completamente rosa y rojo en el medio SMSA.

   3.5?Purificar las colonias de morfología característica mediante subcultivo en un medio nutritivo general. Evitar los subcultivos continuos que pueden dar lugar a una pérdida de virulencia.

4. ?Pruebas de confirmación:

   4.1?Identificación de Ralstonia solanacearum: Identificar los cultivos puros de Ralstonia solanacearum mediante uno, como mínimo, de los siguientes procedimientos.

   Nota: Incluir los controles adecuados en cada prueba.

   Pruebas nutricionales y enzimáticas: Las siguientes propiedades fenotípicas de Ralstonia solanacearum están universalmente presentes o ausentes:

   Pigmento fluorescente	-
   Inclusiones de PHB	+
   Prueba O/F	O+/F-
   Catalasa	+
   Oxidasa de Kovacs	+
   Reducción de nitratos	+
   Utilización de citrato	+
   Crecimiento a 40 ºC	-
   Crecimiento en NaCl al 1 por 100	+
   Crecimiento en NaCl al 2 por 100	-
   Dihidrolasa de arginina	-
   Licuación de gelatina	-
   Hidrólisis del almidón	-
   Hidrólisis de la esculina	-
   Producción de levano	-

   Los medios y métodos se encuentran en Lelliott y Stead (1987).

   Prueba IF: Preparar una suspensión de 10⁶ células por ml del cultivo y de las cepas de control positivo. Preparar una serie de diluciones a 1/2 del antisuero. Aplicar el procedimiento de IF (punto 2 de la sección III). El título IF del cultivo debe ser equivalente al del control positivo.

   Prueba ELISA: Preparar una suspensión de más de 10⁶ células por ml del cultivo y de las cepas de control positivo. Aplicar el procedimiento ELISA (punto 3 de la sección III). El valor ELISA del cultivo debe ser equivalente al del control positivo.

   Prueba PCR: Preparar una suspensión de 10⁶ células por ml del cultivo y de las cepas de control positivo. Aplicar el procedimiento PCR (punto 4 de la sección III). El producto de PCR del cultivo debe tener el mismo tamaño y posteriormente las mismas bandas en el análisis con la enzima de restricción (REA), que el control positivo.

   Hibridación fluorescente in situ (Fluorescent in situ hybridisation o FISH): Preparar una suspensión de 10⁶ células por ml del cultivo y de las cepas de control positivo. Aplicar el procedimiento FISH (Van Beuningen et al., 1995) con el iniciador OLI-1 PCR (Seal et al., 1993). El cultivo debe mostrar la misma reacción que el control positivo.

   Perfiles de proteínas: Las proteínas de células enteras desnaturalizadas se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) según Stead (1992a).

   Perfiles de ácidos grasos (Fatty acid profilingo FAP): Mantener el cultivo y la cepa de control positivo en agar de tripticasa de soja durante 48 horas a 28 ºC y aplicar el procedimiento FAP (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead 1992b). El perfil del cultivo debe ser idéntico al del control positivo. En las condiciones especificadas, los ácidos grasos característicos son 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH y 18:1 2OH.

   4.2?Caracterización de las cepas: La caracterización de las cepas es optativa, pero se recomienda en cada caso nuevo, utilizando, al menos, unas de las pruebas siguientes:

   Determinación de los biovares: Ralstonia solanacearum se divide en biovares en función de la capacidad de producir ácido de tres hexosas alcohólicas y tres azúcares (Hayward, 1964 y 1994).

   	Biovar
   	1	2	3	4	5
   Utilización de:
   Maltosa	-	+	+	-	+
   Lactosa	-	+	+	-	+
   Celobiosa	-	+	+	-	+
   Mannitol	-	-	+	+	+
   Sorbitol	-	-	+	+	-
   Dulcitol	-	-	+	+	-

   El biovar 2 se diferencia en subfenotipos mediante pruebas adicionales (Hayward, 1994):

   	Biovar 2	Biovar 2-A	Biovar 2-T
   Utilización de trehalosa.	-	+	+
   Utilización de inositol..	+	-	+
   Utilización de D-ribosa.	-	-	+
   Actividad pectolítica...	baja	baja	alta

   Determinación de las razas: La raza (Buddenhagen et al., 1962) puede determinarse con una prueba de patogenicidad en plantas de tomate o en berenjenas y en plantas de tabaco, y mediante una reacción de hipersensibilidad (HR) en hojas de tabaco (Lozano y Sequeira, 1970):

   	Raza (*)
   	1	2	3
   Reacción en:
   Plantas de tomate/berenjenas.	Marchitamiento	Sin reacción	Marchitamiento
   Plantas de tabaco.	Marchitamiento	Sin reacción	Sin reacción
   Hojas de tabaco.	Necrosis (48 h) marchitamiento (7-8 días)	HR (12-24 h)	Clorosis (2-8 días)

   (*)?La raza 4 (patógena en el jengibre y en algún otro huésped) y la raza 5 (patógena sólo en la morera) no están incluidas.

   La caracterización de la raza a través de pruebas de patogenicidad o hipersensibilidad en hojas de tabaco puede no ser muy fiable, pero podrá ser deducida a partir del biovar y del huésped original.

   El cultivo puede caracterizarse aún más mediante lo siguiente:

   Obtención de la huella dactilar genómica.

   La diferenciación molecular de las cepas en el complejo de Ralstonia solanacearum puede realizarse del modo siguiente:

   Análisis RFLP (Cook et al.,1989).

   PCR de secuencia repetitiva [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al.,Smith et al.,1995)].

   4.3?Prueba de patogenicidad: Esta prueba se destina a confirmar el diagnóstico de Ralstonia solanacearum y comprobar la virulencia de los cultivos identificados como Ralstonia solanacearum.

   Preparar un inóculo de 10⁶ células por ml de cultivo y una cepa de control positivo. Inocular de 5 a 10 plantas de tomate o berenjenas, preferentemente en la fase de la tercera hoja verdadera o posterior (punto 6 de la sección III). Dejar en incubación hasta dos semanas entre 22 y 28 ºC con alta humedad relativa y riego diario. Observar si se produce marchitamiento y/o epinastia, clorosis o enanismo.

   Aislar la bacteria de las plantas sintomáticas de la forma siguiente:

   separar secciones del tallo 2 cm por encina del punto de inoculación,

   dilacerar y suspender en un pequeño volumen de agua estéril o en tampón fosfato 50mM. Sembrar, dejar en incubación y buscar colonias con morfología típica de Ralstonia solanacearum.

Detección e identificación de Ralstonia solanacearum en muestras de tubérculos de patata

Nota: El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos. Sin embargo, el procedimiento puede adaptarse convenientemente para muestras con menos de 200 tubérculos.

1. ?Preparación de la muestra para el análisis:

   Observación: El extracto de patata obtenido con este procedimiento puede emplearse también para la detección de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

   Opciones previas al análisis, en caso de considerarlas útiles:

   i)?incubar la muestra a 25-30 ºC durante un período de hasta dos semanas para favorecer la multiplicación de las poblaciones latentes de Ralstonia solanacearum; ii) lavar los tubérculos con agua corriente utilizando desinfectantes y detergentes apropiados. Secar al aire los tubérculos.

   1.1?Quitar la epidermis de la parte basal (ombligo) del tubérculo con un bisturí o un cuchillo limpio y desinfectado, de modo que los tejidos vasculares queden a la vista. Extraer con cuidado una pequeña cuña cónica (de 3 a 5 mm de diámetro) de tejido vascular de la parte basal de cada tubérculo. Extraer el mínimo volumen posible de tejido no vascular. Procesar cada uno de los tubérculos de la muestra.

   Observación: El examen visual de los tubérculos (punto 1 de la sección II) puede efectuarse en esta fase. Retirar los tubérculos que presenten síntomas o estén muy podridos y analizarlos individualmente (sección II).

   1.2?Colocar las cuñas en un recipiente cerrado. Es conveniente procesarlas inmediatamente. De no ser posible, pueden almacenarse durante un período de 24 horas como máximo o, si se mantienen a 4 ºC, que no supere las 72 horas.

   1.3?Procesar las cuñas por uno de los métodos siguientes:

   i)?Colocar las cuñas en un recipiente adecuado.

   Añadir solución tampón de maceración (apéndice 2) en cantidad suficiente para que las cubra.

   Desmenuzarlas en una trituradora Waring Blender o Ultra Thurrax hasta lograr una homogeneización completa pero no excesiva.

   Dejar el macerado en remojo de 15 a 30 minutos.

   ii)?Colocar las cuñas en un recipiente adecuado.

   Añadir solución tampón de maceración en cantidad suficiente para que las cubra.

   Colocar el recipiente en un agitador rotatorio.

   Incubar a 50-100 rpm durante 4 horas a 20-22 ºC o durante 16-24 horas a 4 ºC. iii) Colocar las cuñas dentro de una bolsa de maceración desechable que sea resistente (por ejemplo, una bolsa Stomacher, de 105 x 150 mm, estéril por radiación).

   Machacar con cuidado las cuñas valiéndose de un instrumento adecuado, como, por ejemplo, un martillo, hasta lograr una homogeneización completa.

   Añadir solución tampón de maceración en cantidad suficiente para que cubra las cuñas.

   Dejar reposar el macerado durante 15-30 minutos.

   1.4?Extraer las bacterias de las cuñas procesadas mediante uno de los procedimientos siguientes:

   i)?Decantar suavemente el macerado en un tubo de centrifugar y dejar los residuos en el recipiente o la bolsa. Si el decantado presenta un aspecto turbio, centrifugar a 180 g, como máximo, durante 10 minutos, a una temperatura inferior a 10 ºC.

   Centrifugar el decantado o el sobrenadante obtenido en la primera centrifugación, a 7.000 g durante 15 minutos o a 10.000 g durante 10 minutos a una temperatura inferior a 10 ºC.

   Eliminar el sobrenadante sin perturbar el precipitado.

   ii)?Filtrar el macerado mediante un sistema de filtración cuyos poros tengan un tamaño de 40-100 mm. Acelerar la filtración utilizando una bomba de vacío.

   Recoger el filtrado en un tubo de centrifugar.

   Lavar el filtro con un tampón de maceración.

   Centrifugar el filtrado a 7.000 g durante 15 minutos o a 10.000 g durante 10 minutos a una temperatura inferior a 10 ºC.

   Descartar el sobrenadante sin perturbar el precipitado.

   1.5?Resuspender el precipitado en 1 ml de tampón de precipitado (apéndice 2).

   Dividir en dos partes iguales y poner cada parte en un microvial.

   Utilizar un solo microvial para la prueba. Conservar el extracto sobrante a 4 ºC durante el análisis.

   Añadir glicerol estéril al 10-25 por 100 (v/v) al otro microvial. Homogeneizar por agitación. Guardar a -18 ºC (semanas) o a -70 ºC (meses).

2. ?Prueba de inmunofluorescencia (IF): Utilizar un antisuero para Ralstonia solanacearum, de preferencia para raza 3 y biovar 2. Determinar el título en una suspensión de 10⁶ células por ml de la cepa homóloga de Ralstonia solanacearum con una dilución apropiada del conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), según las recomendaciones del fabricante. El antisuero crudo debería presentar un título IF de al menos 1:2.000.

   Utilizar portaobjetos de pocillos múltiples, de preferencia con 10 pocillos de 6 mm de diámetro como mínimo.

   Incluir en cada portaobjetos un control de conjugado FITC. Deberá repetirse la prueba con el control PBS incluido, si se observa alguna célula positiva en el control FITC.

   Preparar en otro portaobjetos controles positivos con una suspensión de 10⁶ células por ml de una cepa de raza/biovar adecuados de Ralstonia solanacearum. Incluir un portaobjetos en cada serie de pruebas.

   2.1?Preparar los portaobjetos según uno de los procedimientos siguientes:

   i)?Para precipitados con una cantidad relativamente pequeña de almidón:

   Echar con una pipeta un volumen determinado (15 µl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) del precipitado resuspendido en una fila de pocillos. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 1.

   ii) Para otros precipitados:

   Preparar diluciones decimales, por ejemplo 1/10, 1/100 y 1/1.000, del precipitado resuspendido en tampón de precipitado. Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (15 µl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) del precipitado resuspendido y de cada dilución en una fila de pocillos. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 2.

   2.2?Dejar secar las gotitas. Fijar las células bacterianas al portaobjetos calentándolo, flameándolo o mediante etanol del 95 por 100.

   2.3?Procedimiento IF:

   i)?Si el portaobjetos se ha preparado según el inciso i) de punto 2.1: Preparar un conjunto de diluciones a 1/2 del antisuero en el tampón IF (apéndice 3): 1/4 del título (T/4), 1/2 del título (T/2), el título (T) y dos veces el título (2T).

   ii)?Si el portaobjetos se ha preparado según el inciso ii) del punto 2.1: Preparar la dilución de trabajo (DT) del antisuero en el tampón IF. La dilución de trabajo es la dilución del antisuero con especificidad óptima, y normalmente es a la mitad del título.

   FIGURA 1

   Preparación del portaobjetos según el inciso i) de los puntos 2.1 y 2.3

   DILUCIÓN NORMALIZADA DEL PRECIPITADO RESUSPENDIDO

   (T=título)

   	FITC	T/4	T/2	T	2T	??Diluciones a 1/2 de antisuero
   Muestra 1	J1	J2	J3	J4	J5
   Duplicado de la muestra 1 o muestra 2	J6	J7	J8	J9	J10

   FIGURA 2

   Preparación del portaobjetos según el inciso ii) de los puntos 2.1 y 2.3

   FITC DILUCIÓN NORMALIZADA DE ANTISUERO

   	Nada	Nada	1/10	1/100	1/1.000	??Dilución decimal precipitado suspendido
   Muestra 1	J1	J2	J3	J4	J5
   Duplicado de la muestra 1 o muestra 2	J6	J7	J8	J9	J10

   2.3.1?Colocar los portaobjetos en un pañuelo de papel humedecido.

   Añadir a los pocillos correspondientes la dilución o diluciones de antisuero. Aplicar PBS en los pocillos FITC. El volumen del antisuero aplicado en los pocillos debe ser equivalente al volumen de extracto aplicado.

   2.3.2?Tapar y dejar incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

   2.3.3?Sacudir las gotitas de antisuero del portaobjetos y enjuagar cuidadosamente los portaobjetos con tampón IF. Lavar durante 5 minutos con tampón IF-Tween. Repetir la operación con tampón IF (apéndice 3). Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad.

   2.3.4?Colocar los portaobjetos en un pañuelo de papel humedecido.

   Cubrir los pocillos en cuestión y el pocillo FITC con la dilución del conjugado FITC utilizado para determinar el título. El volumen de conjugado aplicado en los pocillos debe ser idéntico al volumen de antisuero aplicado.

   2.3.5?Tapar y dejar en incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente.

   2.3.6?Sacudir las gotitas de conjugado del portaobjetos. Enjuagar y lavar como antes (2.3.3). Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad.

   2.3.7?Echar con una pipeta de 5 a 10 µl de tampón fosfato glicerol de 0,1 M (apéndice 3) o un volumen similar en cada pocillo y colocar un cubreobjetos.

   2.4?Lectura de la prueba IF:

   Examinar los portaobjetos en un microscopio epifluorescente con filtros adecuados para que se produzca la excitación del FITC, con aceite de inmersión y a 500-1.000 aumentos. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro.

   En primer lugar, comprobar el control positivo. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas.

   Nota: La prueba debe repetirse si la tinción no es buena en el control positivo.

   Leer los portaobjetos. Observar primero la ausencia de células fluorescentes en los pocillos FITC. Si existieran, indicaría una unión no específica del conjugado, autofluorescencia o contaminación.

   Nota: En este caso, repetir la prueba.

   Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con morfología característica de Ralstoniasolanacearum en los pocillos problema. La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente a la de la cepa de control positivo a la misma dilución del antisuero. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa, a menos que haya muchas células de este tipo (véase la interpretación de los resultados de la prueba IF).

   Interpretación de los resultados de la prueba IF:

   i)?La prueba será negativa si en la muestra no se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica.

   ii)?Si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica, determinar el número medio de células por campo microscópico y calcular el número de células (N) por ml de precipitado resuspendido (apéndice 4).

   Se considera que el límite de detección para la prueba IF está alrededor de 10³ células por ml de precipitado resuspendido:

   en las muestras con NT10³ células por ml, la prueba IF se considera positiva,

   en las muestras con N?10³ células por ml, la prueba IF puede considerarse positiva.

   iii) Si hay un gran número de células (T10⁵ células por ml) incompletamente teñidas o con fluorescencia débil en el título, deberá realizarse una segunda prueba:

   bien una prueba basada en un principio biológico distinto,

   bien repetir la prueba IF, ya sea con un segundo antisuero o con una dilución decimal del precipitado.

3. ?Prueba de inmunoabsorción enzimática (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay o ELISA) (basada en Robinson-Smith et al.,1995).

   Utilizar antisuero para Ralstonia solanacearum, preferiblemente de la raza 3 y biovar 2. Determinar el título en una suspensión de 10⁶ células por ml de la cepa homóloga de Ralstonia solanacearum

   Se recomienda utilizar placas de microtitulación NUNC Polysorp.

   Incluir un control negativo de extracto de patata y un control de tampón fosfato salino (PBS).

   Utilizar una suspensión de más de 10⁶ células por ml de una cepa de Ralstonia solanacearum biovar 2, raza 3, como control positivo. Procesarlo de la misma manera que la muestra o muestras, pero bien separado de éstas en la placa de microtitulación.

   3.1?Echar con una pipeta de 100 a 200 µl del precipitado resuspendido en un microvial.

   Calentar durante 4 minutos a 100 ºC. Colocar el microvial en hielo.

   3.2?Añadir un volumen igual de tampón de tapizado de carbonato de doble concentración (apéndice 5). Homogeneizar por agitación.

   3.3?Añadir alícuotas de 100 µl a cada uno de dos pocillos, como mínimo, de la placa de microtitulación.

   Dejar en incubación durante una hora a 37 ºC o durante una noche a 4 ºC.

   3.4?Quitar los extractos de los pocillos. Lavar éstos tres veces con PBS-Tween (apéndice 5), dejando en ellos la última solución de lavado durante al menos 5 minutos.

   3.5?Preparar la dilución adecuada de antisuero de Ralstoniasolanacearum en tampón de bloqueo (apéndice 5). Echar 100 µl de dilución de antisuero en los pocillos.

   Dejar en incubación durante una hora a 37 ºC.

   3.6?Quitar el antisuero de los pocillos. Lavar éstos como en el punto 3.4.

   3.7?Preparar la dilución adecuada de conjugado de fosfatasa alcalina en tampón de bloqueo. Echar 100 µl de dilución de conjugado en los pocillos.

   Dejar en incubación durante una hora a 37 ºC.

   3.8?Quitar el conjugado de los pocillos. Lavar éstos como en los puntos 3.4 y 3.6.

   3.9?Preparar la solución de sustrato de fosfatasa alcalina (apéndice 5). Echar 100 µl en los pocillos. Dejar en incubación de 30 minutos a una hora en la oscuridad a temperatura ambiente.

   3.10?Leer la absorbancia a 405 nm.

   Interpretación de la prueba ELISA: La prueba ELISA será negativa si la densidad óptica (DO) de la muestra es R 2 x DO del control negativo.

   La prueba ELISA será positiva si la DO de la muestra es T 2 x DO del control negativo.

4. ?;Prueba de polimerización en cadena (Polymerase Chain Reaction o PCR) (Basado en Seal et al., 1993).

   Observación: Deberán utilizarse puntas de pipeta ajustadas con filtro en todas las fases de preparación de la muestra y siempre que haya que manejar PCR.

   Preparar una suspensión de 10⁶ células por ml de una cepa de Ralstonia solanacearum de raza 3 y biovar 2 como control positivo. Actuar del mismo modo que con la muestra o muestras.

   4.1?Echar con una pipeta 100 µl del precipitado resuspendido en un microvial.

   Otra alternativa es echar 90 µl del precipitado resuspendido en un microvial que contenga 10 µl de NaOH 0,5 M. Mezclar invirtiendo el vial repetidamente.

   4.2?Calentar durante 4 minutos a 100 ºC. Colocar el microvial en hielo inmediatamente.

   4.3?Preparar, por lo menos, dos diluciones decimales, por ejemplo 1/10 y 1/100, o más si se considera útil, en agua destilada estéril o ultrapura (UPW).

   4.4?Preparar la mezcla de reacción PCR (apéndice 6) en un vial estéril añadiendo los componentes siguientes en el orden en que se citan:

   Volumen de reacción de 50 µl

   Componente	Cantidad ? µl	Concentración final
   Agua destilada estéril o ultra pura.	30,8-33,8
   10 x tampón PCR	5,0	1 x
   d-ATP	1,0	0,2 mM
   d-CTP	1,0	0,2mM
   d-GTP	1,0	0,2 mM
   d-TTP	1,0	0,2 mM
   Iniciador OLI-1 (20 µM)	2,5	1 mM
   Iniciador Y-2 (20 µM)	2,5	1 mM
   Polimerasa Taq (5 U/µl)	0,2	1,0 U
   Volumen total	45-48

   Para más reacciones:

   Calcular la cantidad de cada componente para el número de reacciones necesario.

   Mezclar los componentes y poner 45-48 µl de la mezcla en viales PCR estériles.

   Colocar los viales con la mezcla de la reacción PCR en hielo.

   Para volúmenes de reacción de 25 µl.

   Reducir los componentes proporcionalmente.

   4.5?Amplificación de la PCR.

   4.5.1?Optativo: centrifugar con impulsos los viales que contienen la muestra hervida y el control positivo.

   Añadir, en el orden indicado, 2-5 µl de la muestra o muestras, el control de agua y el control positivo a los viales que contienen la mezcla de la reacción PCR. Colocar los viales en el calentador del termociclador de ADN.

   4.5.2?Aplicar el siguiente programa: Un ciclo de:

   i)?Dos minutos a 96 ºC: desnaturalización de la cadena molde;

   50?ciclos de:

   ii)?Veinte segundos a 94 ºC: desnaturalización,

   iii) Veinte segundos a 68 ºC: hibridación de iniciador,

   iv)?Treinta segundos a 72 ºC: extensión de la copia;

   Un ciclo de:

   v)?Diez minutos a 72 ºC: nueva extensión;

   Un ciclo de:

   vi)?Mantenimiento de la temperatura a 4 ºC.

   Observación: Estos parámetros son para un aparato Perkin Elmer 9600. Para otros termocicladores tal vez se precise una capa de aceite mineral en los viales de la reacción PCR y/o modificar la duración de las fases ii), iii) y iv) de amplificación.

   4.5.3?Retirar los viales del termociclador. Analizar el producto de la PCR. Si esta operación no se realiza inmediatamente, almacenar los viales a 4 ºC si se van a utilizar el mismo día o a ?18 ºC, si el período de espera va a ser mayor.

   4.6?Análisis del producto de la PCR:

   Los fragmentos de la PCR se detectan mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio.

   4.6.1?Preparar un gel de agarosa apropiado llevando suavemente la agarosa a ebullición en un tampón de tris-acetato para electroforesis (TAE).

   4.6.2?Enfriar la agarosa fundida a 50-60 ºC, verterla en el molde de la unidad de electroforesis e insertar el peine. Dejar solidificar el gel.

   4.6.3?Retirar el peine. Sumergir el gel en TAE de modo que quede cubierto (2-3 mm) con el tampón.

   4.6.4?Poner gotitas de 3 µl de tampón de carga en parafilm. Añadir 12 µl del producto de la PCR procedentes de las muestras, del control positivo o del control de agua, y mezclar aspirando suavemente en la punta de la pipeta antes de la carga. Los volúmenes dados pueden modificarse para que se ajusten a la capacidad de los pocillos en el gel de agarosa.

   4.6.5?Cargar con cuidado los pocillos del gel. Incluir un marcador ADN apropiado al menos en un pocillo, para que sirva de referencia.

   4.6.6?Conectar los cables al generador de electricidad y al equipo de electroforesis. Dejar correr el gel a 5-8 V/cm hasta que la parte delantera del indicador de seguimiento se halle a 1 cm del final del gel.

   4.6.7?Cortar el suministro de electricidad. Desconectar los cables de la unidad de electroforesis.

   Retirar el gel con cuidado. Sumergirlo en una solución de bromuro de etidio durante un período comprendido entre treinta y cuarenta y cinco minutos.

   Observación: Deben llevarse guantes desechables cada vez que se manipule bromuro de etidio, ya que es un mutágeno muy fuerte.

   4.6.8?Desteñir en agua destilada durante 10-15 minutos.

   4.6.9?Visualizar el fragmento o los fragmentos de ADN amplificados mediante transiluminación UV. El producto de la PCR de Ralstonia solanacearum con el conjunto de iniciadores OLI-1 e Y-2 tiene una longitud de 288 bp. Cotejar con el marcador de ADN y con el control positivo.

   Observación: El control de agua debe ser negativo en cualquier caso. De lo contrario, repetir la prueba.

   4.6.10?Hacer una fotografía del gel, en caso de necesitarse una prueba permanente.

   4.6.11?Confirmar la autenticidad del fragmento amplificado mediante un análisis de la enzima de restricción (REA).

   4.7?Análisis de la enzima de restricción (REA):

   4.7.1?Echar 8,5 µl del producto de la PCR (4.5.3) en un microvial nuevo. Añadir 1 µl de tampón de enzima 10 × y 0,5 µl de enzima de restricción AvaII.

   4.7.2?Mezclar aspirando suavemente en la punta de la pipeta. Si quedan gotas en las paredes del vial, dar un pulso en una microcentrífuga. Dejar incubar durante una hora a 37 ºC.

   4.7.3?Analizar el fragmento de la PCR digerido mediante electroforesis en gel de agarosa, tal como se indica en el punto 4.6.

   Interpretación de los resultados de la prueba PCR:

   La prueba PCR es negativa si no se detecta el fragmento 288 bp característico y si se detecta para la cepa de control positivo de Ralstonia solanacearum.

   La prueba PCR es positiva si se detecta el fragmento 288 bp y el análisis REA del fragmento amplificado es idéntico al de la cepa de control positivo de Ralstonia solanacearum.

5. ?Pruebas de siembra en medio selectivo (basadas en Elphinstone et al., 1996):

   5.1?Realizar la prueba mediante una técnica de dilución en placas apropiada, como, por ejemplo:

   i)?Preparar, al menos, dos diluciones decimales, por ejemplo 1/10 y 1/100, o más, si se considera necesario, del sedimento resuspendido en tampón de precipitado. Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (50-100 µl) del sedimento resuspendido y de cada dilución en el medio selectivo SMSA modificado (apéndice 7) y extender con una varilla de vidrio por toda la superficie del medio.

   Si se considera útil, realizar también una estría de dilución con un asa cargada con 10 µl del sedimento resuspendido. Flamear el asa entre cada siembra.

   ii)?Poner un volumen estándar medido (50-100 µl) del sedimento resuspendido en el medio selectivo SMSA modificado y extender con una varilla de vidrio por toda la superficie del medio. Pasar la varilla sin flamearla al menos por otras dos placas de SMSA modificado.

   5.2?Añadir, mediante la misma técnica de dilución en placas, una suspensión de 10⁶ células por ml de una cepa de Ralstonia solanacearum de raza 3 y biovar 2 como control positivo a un conjunto diferente de placas de SMSA modificado.

   5.3?Dejar incubar las placas a 28 ºC. Iniciar su lectura al cabo de tres días. Si el resultado es negativo, esperar hasta seis días como máximo. Los aislados virulentos de Ralstonia solanacearum desarrollan colonias de color blanco lechoso, planas, irregulares y fluidas, con unos centros de color rojo sangre y que pueden presentar rayas o espirales internas.

   5.4?Purificar las colonias de morfología característica mediante subcultivo en un medio nutritivo general (apéndice 1).

   5.5?Identificar los cultivos puros (punto 4.1 de la sección II) y confirmar los cultivos de Ralstonia solanacearum mediante una prueba de patogenicidad (punto 4.3 de la sección II).

   Interpretación de los resultados de la siembra en medio selectivo:

   La siembra en medio selectivo es negativa si no se aíslan colonias bacterianas al cabo de seis días ni se aíslan colonias típicas de Ralstonia solanacearum, siempre que no haya sospechas de inhibición producida por colonias de otras bacterias y que en los controles positivos se encuentren colonias típicas de Ralstonia solanacearum.

   La siembra en medio selectivo es positiva si se aíslan colonias típicas de Ralstonia solanacearum.

6. ?Pruebas de bioensayo (basadas en Janse, 1988):

   6.1?Utilizar en cada muestra 10 plántulas de tomate o de berenjena de variedades que sean sensibles a Ralstonia solanacearum, en la fase de la tercera hoja verdadera. Las plantas no deben regarse durante las 24 horas previas a la inoculación.

   6.2?Distribuir entre las plantas 100 µl de sedimento resuspendido, inoculándolo en el tallo, entre los cotiledones, y en uno o varios puntos más.

   6.3?Utilizando esta misma técnica, inocular 10 plántulas con una suspensión de 10⁶ células por ml de una cepa virulenta de Ralstonia solanacearum de raza 3 y biovar 2 como control positivo y con tampón de precipitado como control negativo. Separar físicamente las plantas inoculadas con el control positivo de las otras para evitar contaminaciones.

   6.4?Dejar que las plantas sigan creciendo hasta cuatro semanas a 22-28 ºC con alta humedad relativa y riego diario. Comprobar si se aprecian síntomas de marchitamiento, epinastia, clorosis y/o crecimiento reducido.

   6.5?Aislar de las plantas infectadas (sección II). Identificar los cultivos puros de morfología característica (punto 4.1 de la sección II) y confirmar los cultivos de Ralstonia solanacearum mediante una prueba de patogenicidad (punto 4.3 de la sección II).

   6.6?Si se considera útil, comprobar si se ha producido infección en los lotes que no presenten síntomas. Separar del tallo de cada planta una sección de 1 cm que esté 2 cm por encima del punto de inoculación. Homogeneizar los tejidos en tampón de maceración. Llevar a cabo la siembra por dilución en placas (punto 5.1 de la sección III). De obtenerse un resultado positivo, identificar los cultivos puros de morfología característica (punto 4.1 de la sección II) y confirmar la presencia de cultivos de Ralstonia solanacearum mediante una prueba de patogenicidad (punto 4.3 de la sección II).

   Interpretación de los resultados de la prueba del bioensayo:

   La prueba del bioensayo es negativa si las plantas no están infectadas por Ralstonia solanacearum, siempre que se detecte Ralstonia solanacearumen los controles positivos.

   La prueba del bioensayo es positiva si las plantas están infectadas por Ralstonia solanacearum.

7. ?Pruebas de enriquecimiento (basadas en Elphinstone et al., 1996):

   7.1?Echar 100 µl de sedimento resuspendido en 3 ml de caldo SMSA modificado (apéndice 7).

   7.2?Dejar incubar a 28 ºC durante 48 horas y, en cualquier caso, durante un máximo de 72 horas, manteniendo el tapón del tubo sin apretar para que haya aireación.

   7.3?Ajustar el tapón y mezclar. Hacer partes alícuotas para la prueba IF (punto 2 de la presente sección), la prueba ELISA (punto 3 de la presente sección) y/o la prueba PCR (punto 4 de la presente sección).

8. ?Pruebas de patogenicidad:

   Véase el punto 4.3 de la sección II.

   APÉNDICE 1

   Medios nutritivos para el aislamiento y el cultivo de Ralstonia solanacearum

   Agar nutritivo (NA):

   Agar nutriente (Difco): 23 g.

   Agua destilada: 1 l.

   Preparar volúmenes de 0,5 litros del medio en matraces de 1 l.

   Disolver los ingredientes.

   Esterilizar en un autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

   Enfriar hasta 50 ºC. Distribuir en placas.

   Agar levadura peptona glucosa (YPGA):

   Extracto de levadura (Difco): 5 g.

   Bacto peptona (Difco): 5 g.

   D (+) glucosa (monohidrato): 10 g.

   Bacto agar (Difco): 15 g.

   Agua destilada: 1 l.

   Preparar volúmenes de 0,5 l del medio en matraces de 1 l.

   Disolver los ingredientes.

   Esterilizar en un autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

   Enfriar hasta 50 ºC. Distribuir en placas.

   Agar de sacarosa y peptona (SPA):

   Sacarosa: 20 g. Peptona: 5 g.

   K₂HPO₄: 0,5 g.

   MgSO₄ · 7H₂O: 0,25 g.

   Bacto agar (Difco): 15 g.

   Agua destilada: 1 l.

   Preparar volúmenes de 0,5 l del medio en matraces de 1 l.

   Disolver los ingredientes. Si es necesario, ajustar el pH a 7,2-7,4.

   Esterilizar en un autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

   Enfriar hasta 50 ºC. Distribuir en placas.

   Medio de tetrazolio de Kelman:

   Casamino ácidos (Difco): 1 g.

   Bacto peptona (Difco): 10 g.

   Dextrosa: 5 g.

   Bacto agar (Difco): 15 g.

   Agua destilada: 1 l.

   Preparar volúmenes de 0,5 litros del medio en matraces de 1 l.

   Disolver los ingredientes.

   Esterilizar en un autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

   Enfriar hasta 50 ºC.

   Añadir una solución acuosa de cloruro de trifenil tetrazolio (Sigma), esterilizada por filtración, para conseguir una concentración final de 50 mg/l. Distribuir en placas.

   APÉNDICE 2

   Materiales para la preparación de muestras

   Tampón de maceración: tampón fosfato 50 mM, pH 7,0:

   Este tampón se utiliza para macerar tejidos.

   Na₂HPO₄: 4,26 g. KH₂PO₄: 2,72 g.

   Agua destilada: 1 l.

   Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.

   Esterilizar en un autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

   Para la realización de la prueba PCR directa, se recomienda añadir polivinilpirrolidona-40.000 MWT (PVP-40) al 5 por 100, para reducir la incidencia de la inhibición de amplificación por moléculas aromáticas presentes en el extracto.

   En el caso de utilizarse los procedimientos de homogeneización con Waring Blender o con Ultra Turrax para la maceración de los tejidos de patata, se recomienda la utilización de un defloculante, un agente antiespumante o un antioxidante.

   Copos de lubrol: 0,5 g/l.

   Antiespumante DC silicona: 1,0 ml/l.

   Tetrasodiopirofosfato: 1,0 g/l.

   Esterilizar separadamente en un autoclave. Añadir hasta obtener la concentración deseada.

   Tampón del precipitado: tampón fosfato 10 mM, pH 7,2:

   Este tampón se utiliza para la resuspensión y dilución de los precipitados y de las cuñas de patata.

   Na₂HPO₄ · 12H₂O: 2,7 g. NaH₂PO₄ · 2H₂O: 0,4 g.

   Agua destilada: 1 l.

   Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.

   Esterilizar en un autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

   APÉNDICE 3

   Materiales para la prueba IF

   Tampón IF: tampón fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2:

   Este?tampón se utiliza para la dilución de antisueros.

   Na₂HPO₄ · 12H₂O: 2,7 g.

   NaH₂PO₄ · 2H₂O: 0,4 g.

   NaCl: 8,0 g.

   Agua destilada: 1 l.

   Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.

   Esterilizar en un autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

   Tampón IF-Tween:

   Este tampón se utiliza para lavar los portaobjetos. Añadir 0,1 por 100 de Tween 20 al tampón IF.

   Tampón fosfato glicerol 0,1 M, pH 7,6:

   Este tampón se utiliza como fluido de montaje en los pocillos de los portaobjetos de IF para aumentar la fluorescencia.

   Na₂HPO₄ · 12H₂O: 3,2 g. NaH₂PO₄ · 2H₂O: 0,15 g.

   Glicerol: 50 ml.

   Agua destilada: 100 ml.

   APÉNDICE 4

   Determinación del nivel de contaminación en la prueba IF

   Superficie (S) del pocillo del portaobjetos múltiple

   en que D = diámetro del pocillo.

   [1]

   Superficie (s) del campo del objetivo

   en que d = diámetro del campo.

   [2]

   Calcular d bien por medición directa, bien con las fórmulas siguientes:

   [3]

   en que

   i = coefeciente de campo (depende del tipo del ocular y varía de 8 a 24),

   K = coeficiente del tubo (1 ó 1,25),

   G = aumento (100x, 40x, etc.) del objetivo.

   De [2]:

   [4]

   De [3]:

   Contar el número de células fluorescentes típicas por campo (c).

   Calcular el número de células fluorescentes típicas por pocillo (C):

   Calcular el número de células fluorescentes típicas por ml de precipitado (N):

   En que = volumen de precipitado en el pocillo,

   F= factor de dilución del precipitado.

   APÉNDICE 5

   Materiales para la prueba ELISA

   Tampón carbonato doble para tapizado, pH 9,6:

   Na₂CO₃: 6,36 g.

   NaHCO₃: 11,72 g.

   Agua destilada: 1 l.

   Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.

   Esterilizar en un autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

   Si el extracto contiene una alta proporción de moléculas aromáticas, puede añadirse como antioxidante sulfito de sodio con una concentración final de 0,2 por 100.

   Tampón fosfato salino (PBS) 10 x, pH 7,4:

   NaCl: 80 g.

   KH₂PO₄: 2 g.

   Na₂HPO₄ · 12H₂O: 29 g.

   KCl: 2 g.

   Agua destilada: 1 l.

   Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.

   Esterilizar en un autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

   Tampón fosfato salino-Tween (PBS-T):

   PBS 10 x: 100 ml.

   Solución al 10 por 100 de Tween 20: 5 ml.

   Agua destilada: 895 ml.

   Tampón de bloqueo (anticuerpos) (debe prepararse en el momento de su utilización):

   PBS 10 x: 10 ml.

   Polivinilpirrolidona-44000 MWT (PVP-44): 2,0 g.

   Solución al 10 por 100 de Tween 20: 0,5 g.

   Leche en polvo: 0,5 g.

   Agua destilada: Hasta completar 100 ml.

   Solución de sustrato fosfatasa alcalina, pH 9,8:

   Dietanolamina: 97 ml.

   Agua destilada: 800 ml.

   Mezclar y ajustar el pH a 9,8 con HCl concentrado.

   Completar hasta 1 l con agua destilada.

   Añadir 0,2 g de MgCl₂.

   Disolver dos pastillas de 5 mg de sustrato fosfatasa (Sigma) por cada 15 ml de solución.

   APÉNDICE 6

   Materiales para la prueba PCR

   Secuencia del oligonucleótido iniciador:

   Iniciador OLI-1: 5?-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3? Iniciador Y-2: 5?CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3? Para los materiales véase Seal et al.,1993.

   APÉNDICE 7

   Materiales para las pruebas de siembra en medio selectivo y de enriquecimiento

   Medio selectivo SMSA (Engelbrecht, 1994, modificado por Elphinstone et al.,1996):

   Medio base

   Casamino ácidos (Difco): 1 g.

   Bacto peptona (Difco): 10 g.

   Glicerol: 5 ml.

   Agar (Difco): 15 g.

   Agua destilada: 1 l.

   Preparar volúmenes de 0,5 ls del medio en matraces de 1 l.

   Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Si es necesario, ajustar el pH a 6,5 antes de esterilizar. Ralstoniasolanacearumno se desarrolla bien con un pH ? 7,0.

   Esterilizar en un autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

   Enfriar hasta 50 ºC.

   Añadir los siguientes ingredientes (todos de Sigma) para obtener las concentraciones finales especificadas:

   Violeta cristal: 5 mg/l.

   Polimixina B sulfato: 100 mg/l (aproximadamente 600.000 unidades) Sigma P-1004.

   Bacitracina (*): 25 mg/l (aproximadamente 1.250 unidades) Sigma B-0125.

   Cloranfenicol: 5 mg/l Sigma C-3175.

   Penicilina G: 0,5 mg/l (aproximadamente 825 unidades9 Sigma P-3032.

   Sales de tetrazolio: 50 mg/l.

   Disolver los ingredientes en etanol del 70 por 100 para obtener las concentraciones indicadas para el volumen de diluyente preparado. Algunos ingredientes, como, por ejemplo, la polimixina B y el cloranfenicol, exigen un ligero calentamiento y agitación.

   Caldo SMSA (Elphinstone et al.,1996).

   Preparar de forma idéntica al medio selectivo SMSA, pero suprimir el agar y las sales de tetrazolio. Distribuir en alícuotas de 3 ml, en tubos desechables Universal de 30 ml.

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   (*)?Si se considera necesario, el aumento de la concentración de bacitracina hasta 300 ppm puede reducir la contaminación por bacterias saprofitas sin reducir la recuperación de Ralstonia solanacearum.

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